Puromycin 嘌呤霉素盐酸盐

作用机制：

嘌呤霉素 （ Puromycin ） 是由白黑链霉菌（ Streptomyces alboniger ）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。嘌呤霉素作为氨酰 -tRNA 分子 3’ 末端的类似物，能够与核糖体的 A 位点结合并掺入到延伸的肽链中。但是嘌呤霉素同 A 位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出 C- 末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽

化学特性：

化学名称： 3 (a -Amino-p-methoxyhydro cinnamamido)- 3–deoxy- N,N–dimethyladenosine·2HCl

CAS No. ： 58-58.2 ，    分子式： C₂₂ H₂₉ N₇ O₅ .2HCl ，   分子量： 544.43 g/mol

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抗性基因：  

对嘌呤霉素的抗性取决于编码嘌呤霉素 N- 乙酰转移酶 (PAC) 的  Pac 基因，遗传工程研究使用的 Pac 基因分离自嘌呤霉素产生菌 Streptomyces alboniger 。  

最普遍应用：

1 ）嘌呤霉素如今普遍应用于筛选和维持培养含 Pac 基因的哺乳动物稳定转染细胞。嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带 pac 基因。

2 ）在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带 pac 基因质粒的大肠杆菌菌株。  

应用浓度：

哺乳动物细胞的推荐使用浓度为 1-10 μ g/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定 。

LB 琼脂培养基筛选稳定转化 pac 基因的大肠杆菌，使用浓度为 125μg/mL 。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的 pH 值调节，而且受宿主细胞本身的影响。

使用步骤：（哺乳动物细胞筛选）

► 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（ shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）

为了筛选到稳定表达待研究 shRNA 的细胞株，确定杀死未转染 / 转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死曲线（ kill curve ）   。

（ 1 ） 24 孔板内以 5~8 x 10⁴ cells/ 孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；

（ 2 ）准备筛选培养基 - 含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如 0-15μg/mL ，至少 5 个梯度）；

（ 3 ）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；

（ 4 ）约 2-3 天更换新鲜的筛选培养基；

（ 5 ）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在 1-4 天之间。

（ 6 ）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始 1-4 天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

► 嘌呤霉素筛选稳定转染细胞

（ 1 ） day 0 ： 24 孔板内以 5~8 x 10⁴ cells/ 孔的密度铺板，孵育过夜；

（ 2 ）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；

（ 3 ） day 1 ：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量 MOI 的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。）

（ 4 ）病毒转导后约 6-8h ，再添加 1ml 完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜；

（ 5 ）病毒转导后 48h ，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。

（ 6 ）约每 2-3 天替换新鲜配制的筛选培养基；

（ 7 ）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及 turboGFP 表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达 TurboGFP 。嘌呤霉素最佳的作用时间在 3-10 天之间。

注：病毒的 MOI 越高，每个细胞含有的 shRNA 拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高 MOI, 含越多 pac 拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。

储存方法和稳定性：

嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后 4 ℃存放；

嘌呤霉素在室温条件下可存放 3 个月， 4 ℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于 -20°C ，保质期为 2 年。

应用文献：  
1. 为了说明 Parp1 基因和 ADP 核糖多聚体位于 Dnmt1 启动子上和说明 Parp1 能够保护自己的非甲基化状态，向培养基中加入 2μg/mL 的嘌呤霉素筛选稳转株，质粒为  pBabe-puro （ Addgene 公司）；

2. 为了研究生化信号通路能够在嘈杂的分子环境下传递信息，采用 6ug/mL 的 puromycin 进行细胞筛选。
3. 为了研究 IRP2 （离子调控蛋白 2 ）特定的 73 个氨基酸插入与该蛋白致瘤特性的关系，采用 2μg/ml   的嘌呤霉素筛选稳定转染的人 H1299 肺癌细胞系。

4. 为了证实在 p53 缺失的细胞中，被 O-GlcNAc 修饰的 IKKβ 的催化活性有所增强，使用了 1μg/ml 的嘌呤霉素 来筛选感染腺病毒（载体为 pBabe HA-IKKβ wild type ）的细胞。
5. 为研究跨膜交互作用在 KAI1/CD82 介导的对癌症侵入和转移的抑制作用中所发挥的角色，使用 2μg/ml 的嘌呤霉素用于筛选稳定的 Du145-sh2 和 -sh3 转导子，并用 1μg/ml 的嘌呤霉素维持培养   （ pSIREN-RetroQ  逆转录病毒转染）。  
6. 为了研究 Per1 在调节肝脏对四氯二苯并 -p- 二恶英反应中的作用，使用了 4μg/ml 的嘌呤霉素筛选稳定感染腺病毒的  Hepa1c1c7 细胞，腺病毒载体为  pSilencer 5.1-U6 Retro Vector (Applied Biosystems/Ambion) 。

7. 为了证实蛋白激酶 PKR 可以诱导细胞凋亡和抑制缺乏 C 蛋白的麻疹病毒亚型的生长，使用  1μg/ml   嘌呤霉素来筛选稳定转染的 HeLa 细胞，载体为  pSUPER.retro.puro Vector 。