|
一、
Western blot概述
Western Blot
法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过
PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如
NC膜，
PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
A.
蛋白抽提
-蛋白样品的制备
|
蛋白抽提试剂
|
|
起始材料
|
产品名称
|
货号
|
规格
|
价格
(RMB)
|
品牌
|
|
大肠杆菌
|
BugBuster protein extraction reagent
|
70584-3
|
100ml
|
1059
|
Merck
|
|
BugBusterMaster Mix extraction reagent
|
71456-3
|
100ml
|
2377
|
Merck
|
|
酵母细胞，真菌，植物
|
YeastBuster protein extraction reagent
|
71186-3
|
100ml
|
1194
|
Merck
|
|
昆虫
/哺乳动物细胞
|
CytoBuster protein extraction reagent
|
71009-3
|
50ml
|
915
|
Merck
|
|
哺乳动物细胞
|
RIPA buffer solution
|
89900
|
100ml
|
923
|
Pierce
|
|
哺乳动物组织
|
T-PER
动物组织蛋白抽提试剂
|
78510
|
500ml
|
3405
|
Pierce
|
|
细胞不同部位蛋白提取试剂盒
|
|
起始材料
|
产品名称
|
货号
|
规格
|
价格
(RMB)
|
品牌
|
|
哺乳动物细胞
/组织
|
ProteoExtract
全蛋白质组抽提试剂盒
|
539779
|
Kit
|
5165
|
Merck
|
|
哺乳动物细胞
/组织
|
ProteoExtract
亚细胞蛋白质组抽提试剂盒
|
539790
|
20T
|
6081
|
Merck
|
|
哺乳动物细胞
/组织
|
ProteoExtract
跨膜蛋白抽提试剂盒
|
71772-3
|
20T
|
6014
|
Merck
|
|
哺乳动物细胞
/组织
|
ProteoExtract
天然跨膜蛋白抽提试剂盒
|
444810
|
KIT
|
5481
|
Merck
|
|
哺乳动物细胞
|
NE-PER
核蛋白
-胞浆蛋白抽提试剂盒
|
78833
|
Kit
|
2586
|
Pierce
|
B.
蛋白酶
/磷酸酶抑制剂
对细胞进行裂解后，与目标蛋白一起释放出来的还有蛋白酶和磷酸酶，它们会水解蛋白为多肽或氨基酸。此过程会导致许多重要蛋白的流失，进而严重的影响下有实验。因此需要在细胞的裂解过程中加入相应蛋白酶或磷酸酶抑制剂，从而保证目标蛋白的完整性。
|
单一成分蛋白酶抑制剂
|
|
抑制剂
|
货号
|
规格
|
价格（
RMB）
|
品牌
|
靶蛋白酶家族
|
可溶解
|
|
PMSF
|
0219538101
|
1g
|
300
|
Mpbio
|
丝氨酸蛋白酶（可逆型）
|
甲醇
|
|
AEBSF
|
J582
|
50mg
|
798
|
Amresco
|
无毒的
PMSF替代物，丝氨酸蛋白酶（不可逆）
|
水
|
|
亮抑蛋白肽（
leupeptin）
|
0215155305
|
5mg
|
871
|
Mpbio
|
丝氨酸
,半胱氨酸蛋白酶（可逆型）
|
水
|
|
抑肽酶
(Aprotinin)
|
0219410105
|
5mg
|
268
|
Mpbio
|
丝氨酸蛋白酶（可逆型）
|
水
|
|
胃抑肽酶
A(Pepstain A)
|
0219536805
|
5mg
|
531
|
Mpbio
|
天冬氨酸蛋白酶（可逆型）
|
甲醇
|
|
抑氨肽酶（
Bestatin）
|
J579
|
10mg
|
1784
|
Amresco
|
氨基酸多肽酶（可逆型）
|
甲醇
|
|
E-64
|
J586
|
5mg
|
1348
|
Amresco
|
可逆型半胱氨酸（不可逆）
|
水
|
|
EDTA
，
2Na
|
0215252290
|
500g
|
1138
|
Mpbio
|
金属蛋白酶（可逆型）
|
水
|
单一蛋白酶抑制剂的作用谱始终是受限制，多数情况下未必能完全保证目的蛋白活性不受影响，尤其需要检测同一样品内的多个蛋白时。“
Cocktail”
-蛋白酶
/磷酸酶混合物此时就是最佳的选择了。
|
蛋白酶抑制剂混合片剂（
EASY packs）
|
|
抑制剂
|
货号
|
规格
|
价格（
RMB）
|
品牌
|
特点
|
|
cOmplete
，
mini
|
5892970001
|
30
片
10ml
|
2470
|
Roche
|
同时持续抑制丝氨酸蛋白酶
,半胱氨酸蛋白酶及金属蛋白酶等在内的多种蛋白酶；可应用几乎所有的组织及细胞提取物，包括动物，植物，酵母，细菌和真菌样品；整个操作过程只需要将片剂完全溶解到裂解液中；
|
|
Complete,mini,EDTA-Free
|
5892791001
|
30
片
10ml
|
2470
|
|
cOmplete
|
4693116001
|
20
片
50ml
|
3339
|
|
cOmplete
，
EDTA-Free
|
4693132001
|
20
片
50ml
|
3339
|
|
磷酸酶抑制剂混合片剂（
EASY packs）
|
|
抑制剂
|
货号
|
规格
|
价格（
RMB）
|
品牌
|
特点
|
|
PhosSTOP
|
14906845001
|
10
片（
10ml）
|
1292
|
Roche
|
同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸（脂）酶，及丝氨酸
/苏氨酸蛋白磷酸（脂）酶和酪酸蛋白磷酸（脂）酶在内的多种酶；与
cOmplete蛋白酶抑制剂兼容。
|
|
PhosSTOP
|
14906837001
|
20
片（
10ml）
|
2432
|
C.
蛋白样品的定量
目前常用比色法来确定样品蛋白的含量。将化学试剂加入到蛋白样品溶液中发生颜色变化，利用分光光度计或酶标仪检测这一变化，并与已知浓度的蛋白标准曲线做比较从而确定样品的浓度。上海伟进提供
Pierce公司的蛋白定量产品，
pierce的
BCA蛋白定量试剂盒是全球最畅销的产品之一，深受研究人员的依赖。
|
常用蛋白定量试剂盒
|
|
产品名称
|
货号
|
规格
|
价格
(RMB)
|
检测波长
|
重要兼容物
|
重要不兼容物
|
蛋白间的均一性
|
|
BCA
蛋白定量试剂盒
|
23227
|
250T
|
1254
|
562nm
|
去污剂
|
还原剂，螯合剂
|
高
|
|
改良
Lowry法蛋白定量试剂盒
|
23240
|
480T
|
1338
|
750nm
|
SDS
|
大部分去污剂，还原剂，螯合剂
|
高
|
|
考马斯蛋白定量试剂盒
|
23200
|
630T
|
1175
|
595nm
|
还原剂和螯合剂
|
去污剂
|
低
|
|
660
纳米蛋白定量试剂盒
|
22662
|
300T
|
2136
|
660nm
|
去污剂，还原剂
|
离子型去污剂
|
低
|
|
蛋白标准品及单一试剂
|
|
产品名称
|
货号
|
规格
|
价格
(RMB)
|
检测波长
|
|
白蛋白标准品
|
23209
|
10*1ml
|
611
|
常用蛋白标准品，高纯度，易获得
|
|
牛血清γ
-球蛋白标准品
|
23212
|
10*1ml
|
765
|
测定抗体浓度时常用的标准品
|
|
BCA
蛋白定量试剂
A
|
23228
|
500ml
|
991
|
成分：碱性碳酸盐缓冲液中含
BCA和酒石酸盐
|
|
BCA
蛋白定量试剂
B
|
23224
|
25ml
|
488
|
成分：
4%无水硫酸铜溶液
|
|
福林酚试剂
|
F9252
|
100ml
|
365
|
Lowry
法总蛋白定量用试剂（
2N）
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
D.
蛋白样品浓缩于纯化
为了节省样本，提高下有实验的成功率，需要对蛋白样品进行浓缩，从而提高蛋白样品的有效检测浓度。在此本公司提供由
Millipore（密理博）的超滤浓缩管（离心过滤），以简单的离心方法将您的蛋白样品浓缩。客户可根据截留的分子量，膜类型，样本体积来选择该产品
|
超滤浓缩管
|
|
产品名称
|
膜类型
|
起始体积
|
浓缩体积
|
回收率
|
规格
|
截留分子量
|
货号
|
|
0.5ml
超滤管
|
Ultracel
（超滤）
|
0.5ml
|
15-20ul
|
≥
90%
|
24
个
/盒
|
3kDa
|
UFC500324
|
|
10kDa
|
UFC501024
|
|
4ml
超滤管
|
Ultracel
（超滤）
|
4ml
|
50ul
|
≥
90%
|
24
个
/盒
|
3kDa
|
UFC800324
|
|
10kDa
|
UFC801024
|
|
15ml
超滤管
|
Ultracel
（超滤）
|
15ml
|
200ul
|
≥
90%
|
24
个
/盒
|
3kDa
|
UFC900324
|
|
10kDa
|
UFC901024
|
E. SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳（
SDS-PAGE）
SDS-PAGE
的基本原理是在蛋白质样品中加入
SDS和含强还原剂巯基乙醇或
DTT的样品处理液。
SDS作为强阴离子表面活性剂，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；强还原剂断开二硫键破坏蛋白质的四级结构，是蛋白质分离解聚成单链分子。解聚后的侧链与
SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质
-SDS复合物，此时蛋白质的电泳迁移率则与所带电荷的性质无关，主要取决于蛋白质的相对分子质量。因此
SDS-PAGE电泳可将不同分子量大小的蛋白质分离开，从而便于对目的蛋白进行研究。
SDS-PAGE
电泳结束后常常通过染色和脱色评定结果的优劣，一般选择考马斯亮蓝
R-250进行染胶，染色灵敏度高。另外也常常对转膜后的凝胶上残余蛋白进行染色，来分析转膜效果的好坏。
|
聚丙烯酰胺凝胶的配置
|
|
产品名称
|
货号
|
规格
|
价格（
RMB）
|
品牌
|
|
丙烯酰胺
/甲叉双丙烯酰胺
Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v)
|
SD6012
|
500ml
|
176
|
Sangon
|
|
丙烯酰胺
/甲叉双丙烯酰胺
Acryl/Bis solution (29: 1), 40% (w/v)
|
SD6017
|
500ml
|
176
|
Sangon
|
|
丙烯酰胺
/甲叉双丙烯酰胺
Acryl/Bis solution (37.5: 1), 40% (w/v)
|
SD6014
|
500ml
|
176
|
Sangon
|
|
十二烷基硫酸钠（
SDS）
|
L5750
|
500g
|
280
|
Sigma
分装
|
|
（
TEMED）
;
N,N,N
’
,N’
-四甲基乙二胺
|
T2250
|
100ml
|
196
|
Sigma
分装
|
|
（过硫酸铵）
Ammonium persulfate
|
0486
|
100g
|
120
|
Amresco
分装
|
|
Western Blotting
缓冲体系的配置
|
|
产品名称
|
货号
|
规格
|
价格（
RMB）
|
品牌
|
|
Tris
|
0234
|
100g
|
105
|
Amresco
分装
|
|
甘氨酸（
Glycine）
|
Japan
|
500g
|
80
|
Japan
|
|
β
-巯基乙醇
-
违禁品
|
0482
|
100ml
|
120
|
Amresco
分装
|
|
Bromophenol blue
溴酚蓝
|
0449
|
10g
|
112
|
Amresco
分装
|
|
Glycerol
甘油
|
G7893
|
250ml
|
95
|
Sigma
分装
|
|
DTT
二硫苏糖醇
|
233155
|
10g
|
330
|
Merck
分装
|
|
考马斯亮蓝
R-250
|
04821616
|
25g
|
389
|
Mpbio
|
|
Ponceau S
丽春红
S
|
0219064410
|
10g
|
273
|
Mpbio
|
|
Lane Marker Reducing Sample Buffer
|
39000
|
5 mL
|
699
|
Pierce
|
|
Lane Marker Non-Reducing Sample Buffer
|
39001
|
5ml
|
699
|
Pierce
|
F
蛋白
Marker
蛋白分子量标准（
Marker）不仅具有指示蛋白条带对应的分子量大小，还可以检测蛋白转移师傅成功或者蛋白样品在凝胶上的电泳程度等作用。选择合适的
Marker不仅方便准确的定性目的蛋白，还能够很好的监测整个实验体系，一遍分析可能遇到的问题，
Fermentas公司提供了各种范围的未染色
/预染色的蛋白
Marker以及修饰标记蛋白
Marker。
|
蛋白
Marker选择
|
|
产品名称
|
旧货号
|
货号
|
规格
|
价格（
RMB）
|
|
PageRuler Unstained Protein Ladder 10-200kDa
|
SM0661
|
26614
|
2*250ul
|
300
|
|
PageRuler Unstained Broad Range Protein Ladder 5-250 kDa
|
SM1881
|
26630
|
2*250ul
|
500
|
|
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10-170kDa
|
SM0671
|
26616
|
2*250ul
|
870
|
|
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 -250kDa
|
SM1811
|
26619
|
2*250ul
|
1100
|
G
转膜与封闭
电泳结束后需要将分离后的蛋白质从凝胶体系中转移到固相载体（如
PVDF膜，
NC膜）上，并在膜上进行一抗，二抗的孵育与洗涤，最后进行显色。使用考马斯亮蓝
R-250对转膜后的凝胶上残余蛋白的检测，可以监测转膜效果的好坏。
|
膜
|
|
产品名称
|
货号
|
规格
/卷
|
促销价（
RMB）
|
膜的选择
|
|
0.2um NC
膜
|
10401396
|
30cm*3.00M
|
2200
|
7-20KD
蛋白
|
|
0.22um PVDF
膜
|
ISEQ00010
|
30cm*3.00M
|
2200
|
适用蛋白测序和低分子量蛋白印迹
|
|
0.45um PVDF
膜
|
IPVH00010
|
26.5cm*3.75m
|
1690
|
适用多种印迹实验
|
封闭（
Blocking）是
western blot 以及其他免疫实验中不可或缺的步骤之一，封闭的好坏直接影响背景高低，从而决定是否能跑出一张美观的
WB图。
WB封闭的目的是结合印迹膜上的非特异性位点，常用的如脱脂奶粉，
BSA，吐温
-20.
|
产品名称
|
货号
|
规格
|
价格（
RMB）
|
品牌
|
|
脱脂奶粉
|
D8340
|
500G
|
385
|
BD
|
|
BSA(
无蛋白酶
)
|
0219989825
|
25g
|
385
|
Mpbio
|
|
BSA
（标准级）
|
0218054925
|
25g
|
300
|
Mpbio
|
|
吐温
-20
|
0210316890
|
500ml
|
238
|
Mpbio
|
H
显色
|
化学显色检测
|
|
产品名称
|
货号
|
规格
|
价格（
RMB）
|
品牌
|
|
DAB(
二氨联苯胺
)
|
0215082501
|
1g
|
211
|
Mpbio
|
|
TMB
（
3,3',5,5'-四甲基联苯胺）
|
0215211601
|
1g
|
858
|
Mpbio
|
|
BCIP(
对甲苯胺蓝
)
|
0219399125
|
25mg
|
420
|
Mpbio
|
|
NBT(
氯化硝基四氮唑蓝
)
|
0219399983
|
250mg
|
932
|
Mpbio
|
|
NBT/BCIP
染色试剂
|
08980871
|
100ml
|
699
|
Mpbio
|
|
DAB
显色试剂盒 黄色
|
AR1021
|
KIT
|
240
|
Boster
|
|
DAB
显色试剂盒 蓝色
|
AR1024
|
KIT
|
240
|
Boster
|
|
AEC
显色试剂盒 红色
|
AR1020
|
KIT
|
140
|
Boster
|
|
NBT/BCIP
染色试剂盒
|
AR1023
|
KIT
|
280
|
Boster
|
|
化学发光检测试剂
|
|
ECL
化学发光底物
|
32109
|
50ml
|
633
|
Pierce
|
|
32106
|
500ml
|
2174
|
Pierce
|
|
SuperSignal West Pico
化学发光底物（皮克级）
|
34080
|
500ml
|
2837
|
Pierce
|
|
SuperSignal West Dura
持久性化学发光底物
|
34075
|
100ml
|
3285
|
Pierce
|
|
超敏化学发光底物
|
34095
|
100ml
|
4263
|
Pierce
|
|
X
光片
|
5*7in
|
100
片
|
160
|
柯达
|
I
抗体剥离与膜再生
当同一个样本中含有两个或两个以上的蛋白需要检测，当对某一个蛋白的检测结果不理想需要调整实验条件货重新分析做验证实验，有了抗体剥离试剂，讲印迹膜上的抗体洗脱，让你在同一张膜上做多次杂交实验，让你免去重复做电泳和转膜的繁琐不走，大大节省你的试验时间和成本。
|
化学显色检测
|
|
产品名称
|
货号
|
规格
|
价格（
RMB）
|
品牌
|
|
Restore TMWestern Blot stripping buffer
|
21062
|
30ml
|
332
|
Thermo
|
|
21059
|
500ml
|
1127
|
Thermo
|
J
内参抗体
内参即内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各种组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用做参照物。
内参的作用：
1检测整个
WB流程是否正常，包括转膜，显色及发光体系等；
2检测基因表达产物是否正确及表达产微量的相对变化；
3校正上样误差，确保蛋白定量结果的可信度；
|
常用的内参抗体
|
|
货号
|
名称
|
适应种属
|
应用范围
|
规格
|
价格（
RMB）
|
|
1854-1
|
β
-actin（
42kDa）
|
HU,Ms
，
Rt
|
WB,IHC,ICC
|
100ul
|
2500
|
|
50ul
|
1400
|
|
2251-1
|
GAPDH
（
36kDa）
|
HU,Ms
，
Rt
|
WB,IHC,ICC
，
IP
|
100ul
|
2500
|
|
50ul
|
1400
|
|
12009-1
|
β
-Tubulin（
50kDa）
|
HU,Ms
，
Rt
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WB,IHC,ICC,FC,IP
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100ul
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2500
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50ul
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1400
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H
标签抗体
伟进公司提供的标签抗体涵盖
6-Histidine，
Flag-tag，
HA tag，
c-Myc，
GST.GFP等常用标签，种类齐全，特异性高，是进行融合蛋白研究不可或缺的辅助工具之一。
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