简介
土壤样品含有大量的微生物,其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究。从土壤样品中提取
DNA
是研究土壤微生物最为有效的方法。目前从土壤样品中提取微生物
DNA
的方法主要有直接法和间接法。直接法是指把土壤样品放在裂解液中,经过有效的破壁方法使微生物的
DNA
全部释放到裂解液中,然后再进行分离提取,如
Zhou
的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中,如
Buffer PBS
等,把微生物从土壤中分离出来,然后再进行
DNA
的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸,重金属盐对
DNA
提取带来的影响,但是这种方法会丢失许多微生物,得到的
DNA
并非土壤样品中的全基因组
(
宏基因组
)
,目前已经很少研究者会采用这种方法。从土壤样品中直接提取
DNA
可最大可能性地获得全基因组,但是这种方法却面临以下几个问题:
1.
腐殖酸的污染。土壤中,特别是森林,草地土壤含有非常丰富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有机物分子,部分分腐殖酸同核酸分子非常类似,在纯化过程中非常难于去除。微量的腐殖酸污染都会导致下游应用,如
PCR
,酶切的失败。
2.
裂解方法。土壤样品中含有各种微生物,如细菌和真菌等。革兰氏阳性细菌和真菌都含有非常厚的细菌壁,让这些微生物的细胞壁有效破裂是提取高产量宏基因组
DNA
的关键。由于土壤样品的复杂性,使用酶法
(
如溶菌酶,破壁酶,蜗牛酶
)
或液氮研磨都不可行,因为土壤中含有各种金属离子或抑制因子导致消化酶的活性失活,或土壤中的沙粒等会导致液氮研磨很难进行。
3.
DNA
得率难于控制。土壤样品或因肥沃,或因贫瘠,或因含水量丰富,或因干枯,或因取样的深浅度,都会造成微生物数量和品种发生剧烈改变。在一个小范围的土壤样品
DNA
含量往往会差别成千上百倍。此外,某些土壤中含有的化学成分,如重金属盐,粘土物质都会造成
DNA
得率降低。
Omega Biotek
公司的
E.Z.N.A. Soil DNA Kit
是目前土壤
DNA
提取最为优化的试剂盒。该试剂盒采用玻璃珠研磨法和热激化学破壁法,可不需特殊的珠磨仪,在点动涡旋仪就可进行,适合于广大的研究室。试剂盒中
HTR Reagent
是
Omega Biotek
公司独家开发的腐殖酸吸附剂,能高效去除各种腐殖酸的污染。此外还采用无醇的硅胶柱纯化方式,可高效去除土壤中各种可溶性金属盐,以及其它可溶性的抑制因子。该试剂盒已经成功地提取如下土壤
(
部分是客户反馈
)
:自然保护区森林的土壤
(
长达
30-40
年森林土壤,表层有
30
-50cm
落叶层
)
,红树林土壤,草地,耕地,海底泥,污泥,矿石区泥土,有机物污染的泥土,池塘泥,垃圾泥,空调管道堆积物等。
实验方法
为表明该试剂盒的优势性,我们选择以下不同组织样品进行
DNA
提取实验,每个样品重复
3
次。
l
森林类样品:自然保护区森林土壤
(
广东黑石顶自然保护区
)
和海南岛红树林保护区
l
矿石区样品:矿石区水底土壤
(
湿
)
和矿石区地表土壤
(
干
)
l
耕地样品:稻田土壤,菜地土壤
l
有机物污染地表样品:污水沟衍泥和生活垃圾堆放区
操作方法(按
Soil DNA Kit
试剂盒进行)简单描述以下:
1.
取▲
0.5
g
森林土壤
/
耕地土壤
,或
◆
4g
矿石区土壤和有机物污染土壤至
15ml
离心管中;
2.
加入▲
0.5g
酸洗玻璃珠,或
◆
4g
酸洗玻璃珠;
3.
加入▲
1ml Buffer SXL MLus
,或
◆
8 ml Buffer SXL MLus
;
4.
立即在涡旋仪上最高速涡旋
3
分钟。
5.
加入▲
100ul
,或◆
800ul Buf
fer DS
,涡旋
15s
混匀
6.
转移至预热至
70
oC
水浴锅中,水浴
10-15
分钟。
7.
3000
x g
离心
3
分钟,转移▲
800ul
,或◆
7 ml
上清,并加入▲
270ul Buffer SP2
或◆
2.3 ml Buffer SP2
,涡旋混匀;
8.
▲
10,000 x g
离心
5
分钟,或
◆
5
,
000 x g
离心
10
分钟;
9.
把上清液转称至新的
2ml/15ml
离心管中,加入
0.7
倍的异丙醇。
(
在处理矿石区样品时和有机物污染的样品中,还加入
133ul
糖原溶液
)
,涡旋混匀;
10.
▲
10,000 x g
离心
5
分钟,或
◆
5
,
000 x g
离心
10
分钟沉淀收集
DNA
。
11.
倒弃上清液,并反扣于吸水纸上
5
分钟;
12.
加入
200 ul Elution Buffer
,涡旋
5
秒。
6
5
℃
水浴
20-60
分钟,让
DNA
充分溶液。
13.
加入
50ul HTR,
反应
2min
后,离心,取上清。
14.
上清加入等体积(约
200ul
)
XP2 Buffer
,均匀后上柱。
15.
加入
300ul XP2 Buffer
,洗涤一次。
16.
加入
700ul SPW Wash Buffer
,洗涤两次。
17.
空甩后,加入适当量的
Elution Buffer
洗脱即可。
实验结果
1.
DNA
电泳结果
取
10 ul
纯化的基因组
DNA
上样于
0.8%
琼脂糖凝胶,
80V
电泳
30
分钟,结果如下。
0.5g
森林类土壤样品
(
前两个自然保护区森林土壤,后两个为红树林土壤
)
0.5g
耕地类土壤样品
A:
水稻田土壤
B:
玉米土壤
4g
有机物污染土壤样品
A:
生活垃圾堆放地
B:
污水沟底泥
4g
矿石泥
1
和
3
是两个矿石区水底土壤
(
湿
)
2
和
4
矿石区地表土壤
(
干
)
2.
DNA
纯度和产量分析
土壤类型
|
A260
|
A280
|
A230
|
A320
|
A260/A280
|
产量
ug
|
6
|
0.1792
|
0.1041< |